Шах Исмаил, желая нейтрализовать узбеков на тот случай, если ему придется сразиться с османами, принял предложение Бабура, но также с условием: Бабур должен принять шиитский толк ислама. Религиозный фанатизм шаха Исмаила соответствовал его территориальным притязаниям, и шах рассчитывал воспользоваться законными правами Бабура на Самарканд как средством присоединить эту область к своей империи. В обмен на военную помощь Бабур обязывался чеканить монету от имени Исмаила и упоминать в хутбе имя шаха, а поскольку то были два непременных символа суверенности, Бабур, по сути дела, превращался в вассала, управляющего Самаркандом по воле иранского шаха. Но поскольку Бабуру было дозволено чеканить свою монету и упоминать свое имя в хутбе в Кабуле, он, далекий от фанатизма, видимо, решил, что ничего не теряет, возвращаясь хотя бы окольным путем в свой возлюбленный Самарканд, и принял, совершенно неразумно, условия шаха.

При таком раскладе шах Исмаил не замедлил отправить Бабуру хорошо вооруженный экспедиционный корпус. Он сам возглавил поход против узбекской армии, которая отступила в степи во избежание полного уничтожения. Победившие войска прошли долину Зеравшан и в октябре 1511 г. были в Самарканде. Бабура встретили с энтузиазмом, таким образом, он в третий раз вернулся в Самарканд. Но скоро радость жителей Самарканда сменилась недоумением, потому что сефевидские отряды шаха Исмаила вели себя грубо и открыто оскорбляли почитаемых халифов.

Популярность Бабура резко упала, а когда войска шаха Исмаила ушли в Иран на зимние квартиры, большая часть его подданных, убежденных суннитов, отказалась помочь ему в борьбе с узбеками, которые вновь появились у стен Самарканда.

Бабур покинул Самарканд с небольшим отрядом верных ему людей и двинулся навстречу узбекам.

Он потерял Самарканд в третий и последний раз и больше туда никогда не возвращался.

Под Бухарой Бабур дал ожесточенное сражение, но проиграл узбекским воинам по причине малочисленности своих войск. Он укрылся за стенами города Хиссар и стал готовиться к обороне. Прибытие новых сефевидских подкреплений дало ему возможность перейти в наступление, но те вели себя по отношению к местному населению еще хуже, чем их предшественники. Увидев почти поголовное истребление людей, включая женщин и детей, возмущенный Бабур объявил о разрыве союза с шахом Исмаилом. Однако до этого дело не дошло – помешали чрезвычайные события.

Изгнанные из Бухары, узбеки отошли в Гадж-Даван, селение, окруженное густым кустарником и рвами, где устроили засаду. Их лучники перебили первые ряды сефевидов, которые наступали в авангарде. Бабур и его всадники снова отступили к Хиссару. Тюрко-монгольские наемники, служившие в его войсках, воспользовались ситуацией и разграбили обоз и даже попытались убить Бабура ночью, когда он спал. Ему удалось бежать; он добрался до Кундуза, где у него были сторонники. Тюрко-монголы разграбили всю округу, но с наступлением зимы они оказались без съестных припасов для себя и корма для своей конницы и были уничтожены узбеками, которые набирали силу и вскоре стали хозяевами всего Мавераннахра.

Два года Бабур находился в Кундузе, правитель которого был его вассалом и родственником, в ожидании каких-либо перемен.

Последняя надежда исчезла, когда в 1514 г. шах Исмаил потерпел сокрушительное поражение в сражении с османами. Смирившись со своей участью, Бабур в сопровождении нескольких верных сторонников вернулся в Кабул после четырехлетнего отсутствия. Там он начал серьезно заниматься своим маленьким государством.

Придворные историографы потомков Бабура в Индии оценивали его трижды не удавшуюся попытку удержать Самарканд как величайшее Божье благословение, а его последняя авантюра с персами, как им казалось, наконец-то изменила направление его честолюбивых устремлений – он перестал думать о севере и обратил свой взгляд на восток. Бабур уже предпринимал попытки проникнуть на территорию Индии через Хайберский перевал с целью почувствовать себя более уверенно по отношению к Шейбани-хану; более того, Хиндустан, а в особенности Пенджаб, он считал, как и Самарканд, своим по праву. Он постоянно возвращался в мыслях к молниеносному завоеванию Индии Темуром в 1399 г.